Dit lekenpraatje gaf ik voorafgaand aan de (online) verdediging van mijn proefschrift, op 10-12-2020
De onderstaande lekensamenvatting is tevens te vinden in de appendix van mijn proefschrift.
Lekensamenvatting
Het waarnemen van de omgeving is een vereiste voor het daarop adequaat kunnen reageren, en dus essentieel om te kunnen overleven. Het in dit proefschrift beschreven onderzoek is gericht op het ontrafelen van de werking van cilia, ook wel de zendmastenn van de cel genoemd. Het correct functioneren van cilia is essentieel voor legio processen in ons lichaam. Fundamentele kennis over hun werking is dus belangrijk. Dit proefschrift levert een bijdrage aan de kennis van het transportmechanisme dat de cilia in staat stelt hun functie als sensor uit te voeren.
De voornaamste functie van primaire cilia is het waarnemen van de omgeving van de cel waartoe zij behoren. Anders dan primaire cilia hebben motile cilia, bewegelijke cilia, de functie om iets buiten te cel te bewegen, zoals ze mucus en vuil uit onze longen bewegen en eicellen bewegen door de eileider. Bij sommige cellen, zoals spermacellen bewegen ze niet de omgeving, maar zichzelf. In dit proefschrift wordt met cilia vrijwel altijd primaire cilia bedoelt.
Cilia zijn haarachtige structuren die uitsteken uit het oppervlak van de cel waartoe ze behoren. Het oppervlak van de cilia zit vol met eiwitten die het opvangen en doorgeven van signalen als functie hebben. Om ervoor te zorgen dat die eiwitten, en andere bouwstenen voor het onderhoud van de cilia, daar komen, bevindt zich in de cilia een onderdeel van het transportsysteem van de cel. Vergelijkbaar met het vrachtvervoer in Nederland, bestaat het uit wegen, zoals het spoor en de weg, motoren, zoals vrachtwagens en locomotieven, en vracht, zoals containers en wagons. Hoewel de wegen in de cel, microtubuli genaamd, er uit zien als een bord gekookte spaghetti, is de weg in de cilia relatief simpel. Vanaf de basis van de naar de tip van de cilium is het een doodlopende weg. Een continue stroom van drie soorten motoreiwitten, de locomotieven en vrachtwagens van de cel, lopen over deze weg om het cilium werkende te houden met de vracht en signalen die ze vervoeren.
De cilia en cellen waar wij naar kijken zijn onderdeel van de nematode Caenorhabditis elegans. Deze wormensoort is volwassen slechts 1 mm lang en leeft buiten het lab in de grond, en voedt zich met bacteriën die zich op rottende vruchten en planten bevinden. C. elegans is een uitstekend modelorganisme, onder andere omdat het transparant is, we de complete DNA code weten en deze aan kunnen passen, en het door het geringe formaat gemakkelijk te onderhouden is. Daarnaast is het mogelijk de wormen in te vriezen, om ze jaren later weer levend te kunnen ontdooien. Dit alles stelt ons in staat om de sensoren, motoren en andere ciliumonderdelen te bekijken in de context van een levend, multi-cellulair organisme.
Om onderzoek te kunnen doen naar hoe de drie verschillende soorten motoreiwitten en hun vracht in de cilia samenwerken en hun functie uitoefenen, bekijken we hun dynamiek met een microscoop. Uit de filmpjes die we opnemen van de onderdelen van het cilium kunnen we bijvoorbeeld hun snelheid en verdeling over de lengte van het cilium kwantificeren. Zodoende kunnen we stap voor stap het mechanisme dat cilia in staat stelt te functioneren als sensor ontrafelen.
Het eerste hoofdstuk van dit proefschrift omschrijft de context van het onderzoek: dat wat al bekend is over transport in cellen, en hoe informatie doorgestuurd wordt vanaf de sensoren in het oppervlak van de cel en cilia.
Hoofdstuk 2 - Onderzoeksmethoden
Het tweede hoofdstuk focust op de techniek die we gebruiken: fluorescentiemicroscopie. Om ervoor te zorgen dat we met een microscoop alleen naar één enkel soort eiwit kijken, bijvoorbeeld een motor in een cilium, labelen we dat eiwit met een fluorescerend eiwit. Door DNA te knip-en-plakken, plakken we een fluorescerend eiwit aan bijvoorbeeld een motoreiwit met een techniek die CRISPR/Cas9 wordt genoemd. Doordat er aan de overige soorten eiwitten in de worm niet een fluorescerend eiwit zit, kunnen we deze onderscheiden van het gelabelde eiwit.
Fluorescentiemicroscopie gaat uit van de eigenschap van sommige materialen en eiwitten dat zij een andere kleur licht uitstralen als waarmee ze beschenen worden. Het veelgebruikte groen fluorescerende eiwit (GFP, voor green fluorescent protein) straalt, zoals de naam impliceert, groen licht uit als het met blauw licht wordt aangestraald. De belangrijkste onderdelen van een fluorescentiemicroscoop zijn dan ook de lasers, die één specifieke kleur licht geven, een objectief, dat voor de vergroting van bijvoorbeeld motoreiwitten in een cilium zorgt, een filter die de aanstraalkleur van de laser kan scheiden van het licht dat het fluorescerende eiwit uitstraalt, en de camera die dat laatste vervolgens kan registreren.
Om ervoor te zorgen dat een worm, bijvoorbeeld een waarin het motoreiwit Kinesine-II met GFP is gelabeld, stil ligt en het experiment overleeft, wordt deze verdoofd en zodanig ingepakt dat het niet uitdroogt. Met de microscoop bestralen we het microscoopglaasje met een worm vervolgens met een laser, en filmen we met een gevoelige camera het licht dat, bijvoorbeeld door de bewegende Kinesine-II motoreiwitten, wordt uitgestraald. De opgenomen filmpjes worden tenslotte met computerprogramma´s geanalyseerd. Deze technieken stellen ons in staat de dynamiek van enkele eiwitten tot op 40 nm en 0,15 seconden nauwkeurig te kunnen bestuderen in een levend multi-cellulair organisme.
Hoofdstuk 3 - Lichtplaatmicroscopie
Een nadeel van een conventionele microscoopopstelling is dat deze het hele monster, bijvoorbeeld een worm, beschijnt. Ook kan men het monster, door de voorbereiding van het monster op een microscoopglaasje, slechts in drie richtingen bewegen. Met lichtplaatmicroscopie wordt alleen het brandvlak van het objectief, daar waar het monster in focus is, belicht. Hierdoor wordt het waarnemen van dat wat in focus is minder beïnvloed door licht wat van buiten het brandvlak op de camera straalt, en zorgt hierdoor voor een scherper beeld. In hoofdstuk drie wordt een lichtplaatmicroscoop omschreven zoals wij die gebouwd hebben, met als specifiek doel het kunnen bekijken van het transportmechanisme in de cellen en cilia van C. elegans. Vier motortjes zorgen ervoor dat het monster optimaal en precies kan worden gepositioneerd. Hoewel het gebruikte objectief niet de benodigde scherpte leverde om transport beter waar te kunnen nemen dan op onze daarvoor gebouwde microscoop, bleek de opstelling uitermate geschikt om driedimensionale filmpjes te kunnen maken van de neuronale celkernen van volwassen C. elegans.
Hoofdstuk 4 - Laser microchirurgie
De cilia van C. elegans die wij bestuderen bevinden zich aan het einde van een uitloper van de zenuw waar het een onderdeel van is. Daarmee zijn de cilia ver weg van de plek waar de onderdelen van de cilia worden gemaakt. Uit eerdere observaties van het transportsysteem in de cilia bleek dat de onderdelen continu heen en weer gaan tussen de basis en tip. Om te onderzoeken in hoeverre cilia gesloten systemen zijn, hebben we met een femtosecondelaser de zenuwuitloper, en dus de aanvoer vanuit de cel, afgesneden vlak voor de cilia, terwijl we de onderdelen van de cilia met fluorescentiemicroscopie bekeken. Uit de resultaten, beschreven in hoofdstuk vier, blijkt dat de respons op het afsnijden van de toevoer in drie fasen te onderscheiden valt. Eerst wordt het motoreiwit dat transport van cilium tip naar basis verzorgt geactiveerd. Vervolgens reikt de microtubuli-weg niet meer tot de tip van de cilium. Tenslotte verlaten de motoren het cilium. Deze experimenten duiden erop dat het afsnijden van de zenuwuitloper een specifiek mechanisme in gang zet dat het transportmechanisme in het cilium in staat stelt om snel te kunnen reageren op prikkels van buitenaf.
Hoofdstuk 5 - De tip van de cilium
In de tip van het cilium bevindt zich het einde van de microtubuli-weg die zich daarin bevindt. Hier moeten de treinen, eenheden gedreven door de motoreiwitten die vracht vervoeren, omkeren. De belangrijkste verandering tussen de trein die van de basis naar tip en die van tip naar basis gaan, is de motor. Op weg naar de tip worden de treinen gedreven door de motoreiwitten Kinesine-II en OSM-3, terug door het motoreiwit dyneïne. Uit onze enkel-molecuul microscopiedata blijkt dat één onderdeel van de trein tot wel drie seconden bij de tip pauzeert, terwijl de anderen vrijwel direct terugkeren naar de basis van het cilium. Dit impliceert dat de trein uit elkaar valt bij de tip, om vervolgens weer in een nieuwe formatie terug te keren.
Hoofdstuk 6 - Respons op stimuli van buitenaf
Het laatste hoofdstuk focust zich op het waarnemen van, en de reactie op, stimuli van buitenaf door het cilium. Door het toevoegen van wateroplosbare chemicaliën gedurende het bestuderen van de ciliumonderdelen met onze fluorescentiemicroscoop, waren we in staat hun reactie direct waar te kunnen nemen. Daaruit bleek dat zowel het motoreiwit dyneïne, de microtubuli weg en het oppervlak-eiwit OCR-2, dat aan het ciliumoppervlak zit, zich terugtrekken uit de tip-regio van de cilium, en ze binnen één minuut weer de pre-stimulus cilium verdeling hebben. Vergelijkbaar met de laser-snijden experimenten uit hoofdstuk vier, laat dit zien dat het cilium in staat is zich snel aan te passen aan zijn omgeving. Om meer te weten te komen over de dynamiek van eiwitten in het oppervlak van cilia, en hoe OCR-2 in staat is zich reversibel te verplaatsen uit de tip-regio, hebben we enkel-molecuul microscopie toegepast op OCR-2. Hieruit bleek dat de dynamiek van het eiwit plaatst afhankelijk is in de cilium. Op plekken zoals de tip en vlak bij de ciliumbasis is diffusie de voornaamste transportwijze. Actief transport door motoreiwitten heeft een hoofdrol in het transport in de zenuwuitloper voor het cilium en in de transitiezone, een zone vlak na de basis die als poort van de cilium fungeert. Tezamen laten onze experimenten zien dat een complexe wisselwerking tussen diffusie en actief transport ervoor zorgt dat OCR-2 zich reversibel kan verplaatsen na een stimulus.
Alles bij elkaar, schetst het onderzoek in dit proefschrift een beeld van een sterk gecoördineerde en dynamische wisselwerking tussen motoreiwitten, hun microtubuli weg, oppervlak-eiwitten en andere ciliumonderdelen, die samen het cilium in staat stellen haar functie als antenne van de cel te kunnen uitoefenen.
Dank aan Annet, Cecilia, Lara en Sabine voor het lezen en becommentariëren van eerdere versies van deze samenvatting.